英文原题：Toward Precision Bioconjugation: Chemical Strategies for Site-Selective Cysteine Conjugation

通讯作者：Kevin Neumann；Institute for Molecules and Materials, Radboud University, The Netherlands

作者：Katerina Gavriel；Kevin Neumann

研究背景：

蛋白质和多肽的化学修饰已广泛应用于化学生物学、治疗性药物研发、生物传感和生物材料研究。通过引入荧光探针、聚乙二醇（PEG）、药物载荷或点击化学反应基团，可实现生物过程追踪、蛋白质性质调控及治疗性偶联物构建。然而，传统化学选择性通常只能识别官能团类型，难以区分同一蛋白中的多个半胱氨酸，因而易产生位点与载药数不确定的异质性产物，并影响蛋白活性、稳定性和药代性质。半胱氨酸侧链硫醇具有较强亲核性，而还原态或游离半胱氨酸残基在天然蛋白质中通常丰度较低，是重要的偶联把手；但要获得结构明确的蛋白偶联物，仍需利用其局部微环境，将半胱氨酸选择性进一步提升为位点选择性。

内容介绍：

这篇综述归纳了半胱氨酸化学位点选择性偶联的三类设计思路：N端半胱氨酸利用相邻α-胺构成的1,2-氨基硫醇结构；C端半胱氨酸可利用His-Cys或Gly-Cys基序经肼解并衔接天然化学连接（NCL），或借助邻近羧酸对特定反应中间体的稳定作用实现位点选择性。

图1. N端、链内及C端半胱氨酸的位点选择性修饰模式

N端半胱氨酸同时含硫醇和游离α-胺，因此可与内部半胱氨酸区分。天然化学连接（NCL）中，硫醇首先与硫酯发生可逆硫酯交换，随后经分子内S→N酰基转移形成稳定的肽键，适用于肽段连接和蛋白质半合成。NHS活化丙烯酸酯则串联硫醇Michael加成与α-胺酰胺化，可用于肽段环化及功能基团的定点引入。

图2. N端半胱氨酸的代表性位点选择性偶联反应，包括天然化学连接（NCL）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化丙烯酸酯、醛类、硼酸衍生物、2-氰基苯并噻唑（CBT）、2-[(烷硫基)(芳基)亚甲基]丙二腈（TAMM）、靛红衍生贝利斯–希尔曼加合物（IBH）、环丙烯酮（CPOs）、2-氰氨基苯硼酸（2CyPBAs）及三嗪–硫醇交换（TriTEx）等

C端半胱氨酸的位点选择性修饰整体更具挑战性，一方面末端羧酸/羧酸盐的反应性低于N端α-胺，另一方面在肽合成中引入C端半胱氨酸时可能发生差向异构化，或发生哌啶诱导的β-消除并生成3-(N-哌啶基)丙氨酸。对于硫代磷鎓策略，邻近羧酸可稳定C端硫代磷鎓物种，从而使其反应行为区别于链内半胱氨酸。

图3. C端半胱氨酸的位点选择性策略，包括肼解及天然化学连接、硫代磷鎓物种形成、脱氢丙氨酸差异化转化及芳基/烷基硫醇正交偶联

链内半胱氨酸缺少末端官能团提供的直接识别，需通过配体、连接臂、识别序列或可逆共价锚定实现定位。此类策略通过提高目标位点附近的局部有效浓度并限定反应几何关系，获得空间选择性。

图4. 邻近残基介导的位点选择性修饰策略。（A）半胱氨酸通过邻近诱导促进赖氨酸酰化；（B）赖氨酸通过可逆亚胺形成促进邻近半胱氨酸的选择性修饰

例如，伊布替尼（ibrutinib）衍生物可选择性定位布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）的第481位半胱氨酸（Cys481），而连接臂的设计可进一步调控反应基团与蛋白质表面的空间位置关系。半胱氨酸还可介导邻近赖氨酸的酰化；反之，赖氨酸形成亚胺鎓离子后，也可促进邻近半胱氨酸的芳基化。此外，π-夹钳（π-clamp）、可与二苯并环辛炔（DBCO）探针选择性反应的半胱氨酸肽标签，以及17个氨基酸组成的铈结合识别序列等策略表明，短肽序列可通过多残基协同作用形成具有特异识别和反应活性的局部微环境。

总体而言，N端修饰方法较为丰富，但通常需预先引入半胱氨酸；C端修饰受底物制备困难及末端羧酸反应性较低等因素限制；链内半胱氨酸修饰可直接针对天然位点，但往往依赖蛋白质构象、配体识别或连接臂设计。三嗪–硫醇交换（TriTEx）等动态共价策略可通过pH调控位点选择性，但本文所述TriTEx体系的反应速率较慢，限制了其在蛋白质修饰中的应用；传统半胱氨酸–马来酰亚胺偶联仍具有较高实用性，但其连接稳定性有限，且在存在多个可反应半胱氨酸时难以实现严格的位点选择性。

总结/展望：

位点选择性半胱氨酸偶联利用N端1,2-氨基硫醇、C端羧酸及链内位点的空间邻近效应，实现精准修饰，推动蛋白质修饰由官能团选择性迈向位点精确控制。这些策略为均一抗体偶联物、蛋白质探针、肽段连接及生物材料构建等提供了重要工具。

未来研究应进一步提升链内半胱氨酸修饰的反应速率、底物普适性与位点选择的可预测性，减少对特定配体及识别序列的依赖，并系统阐明蛋白质构象、局部微环境和反应介质对半胱氨酸反应性的调控机制。以三嗪–硫醇交换（TriTEx）为代表的策略表明，精准生物偶联正在由经验驱动的试剂开发，逐步迈向机制指导、位点可控和可编程的分子工程。

Cite this: Gavriel, K.; Neumann, K. Toward Precision Bioconjugation: Chemical Strategies for Site-Selective Cysteine Conjugation. Precision Chemistry 2026. https://doi.org/10.1021/prechem.5c00323