英文原题：Real-Time, In Situ Monitoring of Single Extracellular Vesicles via Restricted Nanopore-Based Zero-Mode Waveguides

通讯作者：Paul W. Bohn - 美国印第安纳州圣母大学化学与生物分子工程系

作者：Jarek Metro, Abigail A. Weaver, Julius Reitemeier, Charlie Desnoyers, Paul W. Bohn

中文供稿人：孙佳宇，崇媛媛，中国科学技术大学

研究背景：

细胞外囊泡（EV）是介导细胞间通讯、疾病标志物和疫苗开发的关键载体，但其群体具有高度异质性，传统检测方法依赖超速离心等耗时步骤且无法实现单颗粒分析。现有单颗粒技术（如原子力显微镜）通量低，而免疫分析法需复杂预处理。本研究提出一种基于零模式波导纳米孔（ZMW）的原位检测技术：利用300 nm孔径的ZMW阵列物理排除细菌细胞，结合脂膜荧光标记，直接对原始培养液中的EV进行高通量实时观测。该方法无需样品纯化，可并行监测441个纳米孔内单颗粒行为，为研究细菌应激响应提供了新工具。

内容介绍：

1. 纳米孔阵列的精准尺寸设计

ZMW孔径（顶部300 nm/底部200 nm）允许20-300 nm的EV自由扩散进入检测区，同时阻挡>300 nm的细菌细胞。锥形结构结合金-二氧化硅复合层，将激发光限制在zeptoliter级光学腔内，实现单颗粒荧光信号的精准捕获（图1）。

图1. 零模式波导表征与检测方案：(A) 零模式波导阵列表面的俯视扫描电子显微镜（SEM）图像（局部展示）；(B) 单个纳米孔的横截面SEM图像；(C) 宽场荧光成像图，显示从零模式波导纳米孔中逸出的EV经DiO染料标记的荧光信号；(D) （上）单个纳米孔在60秒内采集的荧光信号强度变化曲线；（下）示意图分步展示EV的动态行为：(i) 进入纳米孔前处于"关闭"状态的空间位置；(ii) 进入光学检测区时切换为"开启"状态；(iii) 离开纳米孔后恢复"关闭"状态。

2. 实时揭示EV动态异质性

在铜绿假单胞菌培养液中，未处理样本的EV平均驻留时间为2.9秒，而经0.45 μm滤膜过滤后，因粘度降低和小囊泡比例增加，驻留时间显著缩短至2.2秒（图2）。通过对比野生菌与ΔpqsA突变株（囊泡生成机制不同），发现后者因裂解产生的大囊泡（平均330 nm）驻留时间延长，事件频率降低，首次证实制备方法对EV物理特性的影响。

图2. 样品制备方法对ZMW中EV行为的影响：(A) EV样品在加载至零模式波导前的制备流程示意图；(B) 单个代表性纳米孔的峰识别过程：原始信号经移动平均法平滑处理后，通过阈值设定检测特征峰；(C) 每个纳米孔检测到EV事件的相对频率；(D) 不同样本（细菌培养液、上清液、滤液）中特征峰宽度（twidth）的相对频率分布；(E) 直方图展示：(i) 单孔平均事件频率，(ii) 特征峰宽度。显著性判定分别采用：(i) 双尾t检验，(ii) Mann–Whitney U检验。误差线代表均值标准误，* p ≤ 0.05，*** p ≤ 0.001。

3. 抗生素刺激的实时监测

加入10 μg/mL环丙沙星后，EV生成速率在30分钟内提升40%，并伴随粒径分布向小尺寸偏移。该方法首次实现抗生素作用下囊泡群体的动态追踪，为研究细菌耐药机制提供了新视角（图3）。

图3. 突变株与野生型铜绿假单胞菌的EV生成对比： (A) 野生型铜绿假单胞菌（WT）与ΔpqsA突变株（膜泡出芽机制介导的EV生成存在缺陷）的EV相对尺寸分布； (B) 平均数据展示：(i) 单孔事件数，(ii) 特征峰宽度。显著性判定分别采用：(i) 双尾t检验，(ii) Mann–Whitney U检验。误差线表示均值标准误，*** p ≤ 0.001。

总结/展望：

本研究通过零模式波导纳米孔阵列实现了细菌EV的原位、高通量单颗粒检测，突破了传统方法依赖纯化的局限。未来可拓展至革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）及真核细胞EV分析，并整合表面蛋白标记实现功能分型。该技术为感染性疾病诊断、疫苗开发及微生物-宿主互作研究提供了全新平台。

Cite this: Metro, J.; Weaver, A. A.; Reitemeier, J.; Desnoyers, C.; Bohn, P. W. Monitoring Populations of Single Extracellular Vesicles from Pseudomonas Aeruginosa Using Large Parallel Arrays of Zero-Mode Waveguides. Precision Chemistry 2025, 3 (6), 348–356. https://doi.org/10.1021/prechem.5c00012.